刺萼龙葵ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选
刺萼龙葵ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选(毕业论文10200字)
摘 要：以刺萼龙葵基因组DNA为模板，利用正交设计，对影响简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的主要因素（Taq酶、Mg2+浓度、dNTP、引物及模板DNA）进行筛选和优化，建立适合刺萼龙葵ISSR-PCR反应体系。优化后的ISSR-PCR反应体系为：20 ul反应体系包括ddH2O 5.4 ul，10×PCR Buffer（Mg2+ Free）2 ul，MgCl2（1.25mM）1.6 ul，1uM引物1.6 ul，dNTP（1.25mM each）6.4ul，rTaq酶（0.5U/ul）1ul，模板(20ng/ul) 2ul。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性45，50℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次，72℃延伸8min，16℃保存。这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行刺萼龙葵鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。
关键词：刺萼龙葵、外来入侵植物、ISSR-PCR、正交设计、引物筛选
Optimization of an ISSR-PCR System and Primer Screening for Solanum rostratum Dun
Abstract: Template DNA used for ISSR was extracted from Solanum rostratum leaf tissue. The orthogonal design was applied to optimize ISSR amplification system of five factors (Taq DNA polymerase, Mg2+, dNTP, DNA template and primer concentration) respectively. An optimal reaction system was established, 20μl reaction system contained ddH2O 5.4ul, 10×PCR Buffer(Mg2+ Free) 2ul, Mg2+ (1.25mM) 1.6ul, 1uM primer 1.6ul, dNTP (1.25mM) 6.4ul, (0.5U/ul)rTaq polymerase 1ul, (20ng/ul) DNA 2ul. The PCR amplification program included pre-denaturation at 94℃ for 5min; denaturation at 94℃for 45s; annealing at 50.0℃ for 1 min; extending at 72℃ for 1 min; after 35 cycles, the product was extended at 72℃ for 8 min and finally maintained at 16℃. This optimal system lay the standardization program for the identification of Solanum rostratum and the genetic diversity analysis of its germplasm resource. [资料来源：http://doc163.com]
Keywords：Solanum rostratum Dun ；invasive plant ；ISSR-PCR；Orthogonal design; primer screening [来源：http://Doc163.com]
目 录
摘要 1
关键词 1
1 前言 2
1.1 刺萼龙葵简介 2
1.1.1 刺萼龙葵的形态学特征 2
1.1.2 刺萼龙葵的生物学与生态学特性 3
1.1.3 刺萼龙葵的为害 3
1.1.4 刺萼龙葵的分布现状 3
1.2 ISSR分子标记技术简介 3
1.2.1 ISSR技术的原理 4
1.2.2 ISSR分子标记技术优缺点 5
1.2.3 ISSR技术在植物上的应用 5
1.2.4 研究目的及意义 6
2 材料与方法 6
2.1 试验材料 6
2.2 酶、试剂及仪器 6
2.3 方法 7
2.3.1 刺萼龙葵基因组DNA的提取 7
2.3.2 基因组DNA浓度和纯度的检测 7
2.3.3 ISSR—PCR反应体系的建立与优化 8
3 结果与分析 10
3.1 刺萼龙葵基因组DNA电泳检测 10
3.2 刺萼龙葵基因组DNA分光光度计检测 10
3.3 正交设计直观分析 11
4 讨论 12
4.1 影响DNA质量的因素 12
4.2 刺萼龙葵ISSR-PCR反应体系 13
5 结论 14
参考文献 14
致谢 16
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