干细胞分化过程中的荧光示踪体系构建

干细胞分化过程中的荧光示踪体系构建(12000字)
摘  要：目的 构建含强启动子和双报告基因（绿色荧光蛋白及荧光素酶报告基因）的慢病毒骨架质粒（Lv-Ef1α-LUC-IRES-EGFP），并扩增出预测的胰岛素启动子片段，为研究干细胞向胰岛分化过程中的示踪方法奠定了基础。方法 设计引物，采用PCR技术扩增LUC报告基因及预测的INS启动子片段，并构建Lv-ef1α-LUC-IRES-EGFP慢病毒骨架质粒。结果：成功构建了含双报告基因的慢病毒骨架质粒，并成功扩增得到预测的胰岛素启动子片段。
关键词：干细胞；分化；示踪；慢病毒

The Florescent Imaging System during The Differentiation of Stem Cells
—Construction of Double Reporter Gene System and Cloning of Insulin Promoter
Abstract: Objective: The lentiviral skeleton plasmid (Lv-ef1α-LUC-IRES-EGFP) containing ef1α promoter gene and double reporter gene (Firefly Luciferase and Green Fluorescent Protein reporter gene) was constructed, which laying a foundation on imagine the process of inducing the embryonic stem cells into pancreas Cells. Methods: To design primers, gene segments of anticipatory insulin promotor and LUC reporter gene were cloned by PCR technology, and constructed Lv-ef1α-LUC-IRES-EGFP lentiviral skeleton plasmid. Results: The plasmid Lv-ef1α-LUC-IRES-EGFP is constructed, and the gene segment of anticipatory insulin promotor was cloned successfully.

目    录
摘  要    1
关键词    1
1  前言    2
1.1  胚胎干细胞    2
1.1.1  胚胎干细胞的应用前景    2
1.2  示踪体系中的报告基因    2
1.2.1  荧光素酶    3
1.2.2  绿色荧光蛋白    3
1.3  胰腺细胞特异性启动子    4
1.3.1  胰腺细胞特异性标志物    4
1.3.2  特异性启动子    4
1.4  慢病毒载体    4
1.4.1  慢病毒载体的特点    4
1.5  糖尿病简介    5
2  材料和方法    5
2.1  实验材料与仪器    5 [资料来源：Doc163.com]
2.1.1  实验材料    5
2.1.2  主要仪器    6
2.1.3  溶液配制    6
2.2  实验方法    7
2.2.1  构建Lv-ef1α-LUC-IRES-EGFP质粒    7
2.2.2  质粒大量提取    11
2.2.3  慢病毒制备    12
2.2.4  重组质粒功能鉴定    13
2.2.5  克隆特异性启动子    14
3  实验结果与分析    15
3.1  荧光素酶的克隆    15
3.1.1  LUC温度梯度PCR产物电泳鉴定    15
3.1.2  在最佳退火温度下克隆回收LUC基因    16
3.1.3  双酶切PCR产物回收鉴定    16
3.2  重组质粒鉴定    17
3.3  辅助质粒双酶切鉴定    17
3.4  质粒大量提取浓度检测    18
3.5  慢病毒制备及滴度检测    18
3.6  慢病毒功能鉴定    19 [资料来源：http://Doc163.com]
3.6.1  慢病毒感染MDA-MB-231细胞    19
3.6.2  荧光素酶测定    19
3.7  扩增特异性启动子    20
3.7.1  胰岛素启动子温度梯度PCR鉴定    20
3.7.2  特异性启动子回收鉴定    20
4  结论    21
参考文献    21
致    谢    22 [资料来源：https://www.doc163.com]